IPTG (izopropyl-β-D-tiogalaktozid) je analóg substrátu β-galaktozidázy, ktorý je vysoko indukovateľný.Pri indukcii IPTG môže induktor tvoriť komplex s represorovým proteínom, takže konformácia represorového proteínu sa zmení, takže sa nemôže kombinovať s cieľovým génom a cieľový gén sa účinne exprimuje.Ako by sa teda mala počas experimentu určiť koncentrácia IPTG?Čím väčšie, tým lepšie?
Najprv pochopme princíp indukcie IPTG: laktózový operón (element) E. coli obsahuje tri štruktúrne gény Z, Y a A, ktoré kódujú β-galaktozidázu, permeázu a acetyltransferázu.lacZ hydrolyzuje laktózu na glukózu a galaktózu alebo na alo-laktózu;lacY umožňuje laktóze v prostredí prejsť cez bunkovú membránu a vstúpiť do bunky;lacA prenáša acetylovú skupinu z acetyl-CoA na β-galaktozid, čo zahŕňa odstránenie toxického účinku.Okrem toho existuje operačná sekvencia O, štartovacia sekvencia P a regulačný gén I. Kód génu I je represorový proteín, ktorý sa môže viazať na pozíciu O operátorovej sekvencie, takže operón (meta) je reprimovaný a vypnutý.Existuje tiež väzbové miesto pre väzbové miesto katabolického génového aktivátora proteín-CAP pred iniciačnou sekvenciou P. Sekvencia P, O sekvencia a väzbové miesto CAP spolu tvoria regulačnú oblasť lac operónu.Kódujúce gény troch enzýmov sú regulované rovnakou regulačnou oblasťou, aby sa dosiahla koordinovaná expresia génových produktov.
V neprítomnosti laktózy je lac operón (meta) v stave represie.V tomto čase sa lac represor exprimovaný I sekvenciou pod kontrolou PI promótorovej sekvencie viaže na O sekvenciu, ktorá bráni RNA polymeráze naviazať sa na P sekvenciu a inhibuje iniciáciu transkripcie;ak je prítomná laktóza, lac operón (meta) môže byť indukovaný. V tomto systéme operónu (meta) skutočným induktorom nie je samotná laktóza.Laktóza vstupuje do bunky a je katalyzovaná β-galaktozidázou, aby sa premenila na alolaktózu.Ten sa ako induktorová molekula viaže na represorový proteín a mení proteínovú konformáciu, čo vedie k disociácii represorového proteínu od O sekvencie a transkripcii.Izopropyltiogalaktozid (IPTG) má rovnaký účinok ako alolaktóza.Je to veľmi silný induktor, ktorý nie je metabolizovaný baktériami a je veľmi stabilný, preto je široko používaný v laboratóriách.
Ako určiť optimálnu koncentráciu IPTG?Vezmite si ako príklad E. coli.
Geneticky upravený kmeň E. coli BL21 obsahujúci pozitívny rekombinantný pGEX (CGRP/msCT) sa naočkoval do LB tekutého média obsahujúceho 50 ug.ml-1 Amp a kultivoval sa cez noc pri 37 °C.Vyššie uvedená kultúra bola naočkovaná do 10 fliaš s 50 ml čerstvého tekutého média LB obsahujúceho 50 ug.mL-1 Amp v pomere 1:100 pre expanznú kultúru, a keď bola hodnota OD600 0,6~0,8, pridal sa IPTG do konečnej koncentrácie.Je to 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0 mmol·l-1.Po indukcii pri rovnakej teplote a rovnakom čase sa z nej odobral 1 ml bakteriálneho roztoku a bakteriálne bunky sa zhromaždili centrifugáciou a podrobili sa SDS-PAGE na analýzu vplyvu rôznych koncentrácií IPTG na expresiu proteínu a potom vyberte koncentráciu IPTG s najväčšou expresiou proteínu.
Po experimentoch sa zistí, že koncentrácia IPTG nie je taká veľká, ako je to možné.Je to preto, že IPTG má určitú toxicitu pre baktérie.Prekročenie koncentrácie tiež zabije bunku;a všeobecne povedané, dúfame, že čím viac rozpustného proteínu sa exprimuje v bunke, tým lepšie, ale v mnohých prípadoch, keď je koncentrácia IPTG príliš vysoká, sa vytvorí veľké množstvo inklúzie.Telo, ale množstvo rozpustných bielkovín sa znížilo.Preto často nie je najvhodnejšia koncentrácia IPTG čím väčšia, tým lepšia, ale čím nižšia je koncentrácia.
Účelom indukcie a kultivácie geneticky upravených kmeňov je zvýšiť výťažok cieľového proteínu a znížiť náklady.Expresiu cieľového génu neovplyvňujú len vlastné faktory kmeňa a expresný plazmid, ale aj ďalšie vonkajšie podmienky, ako je koncentrácia induktora, teplota indukcie a doba indukcie.Preto je vo všeobecnosti pred exprimovaním a purifikáciou neznámeho proteínu najlepšie študovať indukčný čas, teplotu a koncentráciu IPTG, aby ste vybrali vhodné podmienky a získali najlepšie experimentálne výsledky.
Čas odoslania: 31. decembra 2021