IPTG (izopropyl-β-D-tiogalaktozid) je analóg substrátu β-galaktozidázy, ktorý je vysoko indukovateľný. Pri indukcii IPTG môže induktor vytvoriť komplex s represorovým proteínom, čím sa zmení konformácia represorového proteínu, takže sa nemôže spojiť s cieľovým génom a cieľový gén sa efektívne exprimuje. Ako by sa teda mala určiť koncentrácia IPTG počas experimentu? Čím väčšia, tým lepšia?
Najprv si vysvetlime princíp indukcie IPTG: Laktózový operón (element) E. coli obsahuje tri štrukturálne gény, Z, Y a A, ktoré kódujú β-galaktozidázu, permeázu a acetyltransferázu. lacZ hydrolyzuje laktózu na glukózu a galaktózu alebo na alolaktózu; lacY umožňuje laktóze z prostredia prejsť cez bunkovú membránu a vstúpiť do bunky; lacA prenáša acetylovú skupinu z acetyl-CoA na β-galaktozid, čo zahŕňa odstránenie toxického účinku. Okrem toho existuje operačná sekvencia O, štartovacia sekvencia P a regulačný gén I. Kód génu I je represorový proteín, ktorý sa môže viazať na pozíciu O operátorovej sekvencie, takže operón (meta) je potlačený a vypnutý. Pred iniciačnou sekvenciou P sa nachádza aj väzbové miesto pre väzbové miesto CAP pre katabolický aktivátorový proteín génu. Sekvencia P, sekvencia O a väzbové miesto CAP spolu tvoria regulačnú oblasť lac operónu. Kódujúce gény týchto troch enzýmov sú regulované rovnakou regulačnou oblasťou, aby sa dosiahla koordinovaná expresia génových produktov.
V neprítomnosti laktózy je lac operón (meta) v stave represie. V tomto čase sa lac represor exprimovaný sekvenciou I pod kontrolou promótorovej sekvencie PI viaže na sekvenciu O, čo bráni väzbe RNA polymerázy na sekvenciu P a inhibuje iniciáciu transkripcie; keď je prítomná laktóza, môže byť indukovaný lac operón (meta). V tomto operónovom (meta) systéme skutočným induktorom nie je samotná laktóza. Laktóza vstupuje do bunky a je katalyzovaná β-galaktozidázou, ktorá ju premieňa na alolaktózu. Tá sa ako induktorová molekula viaže na represorový proteín a mení konformáciu proteínu, čo vedie k disociácii represorového proteínu od sekvencie O a transkripcii. Izopropyltiogalaktozid (IPTG) má rovnaký účinok ako alolaktóza. Je to veľmi silný induktor, ktorý nie je metabolizovaný baktériami a je veľmi stabilný, preto sa široko používa v laboratóriách.
Ako určiť optimálnu koncentráciu IPTG? Vezmime si ako príklad E. coli.
Geneticky modifikovaný kmeň E. coli BL21 obsahujúci pozitívny rekombinantný pGEX (CGRP/msCT) bol inokulovaný do tekutého média LB s obsahom 50 μg·mL-1 Amp a kultivovaný cez noc pri teplote 37 °C. Vyššie uvedená kultúra bola inokulovaná do 10 fliaš s 50 ml čerstvého tekutého média LB s obsahom 50 μg·mL-1 Amp v pomere 1:100 pre expanznú kultúru a keď hodnota OD600 bola 0,6 až 0,8, bol pridaný IPTG do konečnej koncentrácie. Tá je 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0 mmol·L-1. Po indukcii pri rovnakej teplote a rovnakom čase sa z neho odobral 1 ml bakteriálneho roztoku a bakteriálne bunky sa zozbierali centrifugáciou a podrobili SDS-PAGE, aby sa analyzoval vplyv rôznych koncentrácií IPTG na expresiu proteínov a potom sa vybrala koncentrácia IPTG s najväčšou expresiou proteínov.
Po experimentoch sa zistí, že koncentrácia IPTG nie je čo najvyššia. Je to preto, že IPTG má určitú toxicitu pre baktérie. Prekročenie koncentrácie tiež zabije bunku; a vo všeobecnosti dúfame, že čím viac rozpustného proteínu je exprimované v bunke, tým lepšie, ale v mnohých prípadoch, keď je koncentrácia IPTG príliš vysoká, sa vytvorí veľké množstvo inklúzií v tele, ale množstvo rozpustného proteínu sa zníži. Preto najvhodnejšia koncentrácia IPTG často nie je čím väčšia, tým lepšia, ale čím nižšia koncentrácia.
Účelom indukcie a kultivácie geneticky modifikovaných kmeňov je zvýšiť výťažok cieľového proteínu a znížiť náklady. Expresiu cieľového génu ovplyvňujú nielen vlastné faktory kmeňa a expresný plazmid, ale aj ďalšie vonkajšie podmienky, ako je koncentrácia induktora, indukčná teplota a indukčný čas. Preto je vo všeobecnosti pred expresiou a purifikáciou neznámeho proteínu najlepšie študovať indukčný čas, teplotu a koncentráciu IPTG, aby sa vybrali vhodné podmienky a dosiahli sa najlepšie experimentálne výsledky.
Čas uverejnenia: 31. decembra 2021