Ditiotreitol (DTT) je bežne používané redukčné činidlo, známe aj ako nová zelená prísada. Je to organická zlúčenina s nízkou molekulovou hmotnosťou a dvoma merkaptánovými skupinami (-SH). Vďaka svojim redukčným vlastnostiam a stabilite sa DTT široko používa v biochemických a molekulárno-biologických experimentoch.
Hlavnou úlohou DTT je redukcia disulfidových väzieb v proteínoch a iných biomolekulách. Disulfidová väzba je dôležitou súčasťou skladania a stability proteínov, ale za určitých experimentálnych podmienok, ako je analýza redukovateľnej SDS-PAGE, rekombinácia a skladanie proteínov, je potrebné redukovať disulfidovú väzbu na dve tiolové skupiny, aby sa rozmotala priestorová štruktúra proteínu. DTT môže reagovať s disulfidovými väzbami a redukovať ich na merkaptánové skupiny, čím sa otvára priestorová štruktúra proteínu a uľahčuje sa jeho analýza a manipulácia.
DTT sa môže použiť aj na ochranu aktivity a stability enzýmu. Pri niektorých enzýmami katalyzovaných reakciách môže byť aktivita enzýmu znížená oxidačným činidlom. DTT môže reagovať s oxidačnými činidlami a redukovať ich na neškodné látky, čím chráni aktivitu a stabilitu enzýmu.
V porovnaní s tradičnými redukčnými činidlami, ako je β-merkaptoetanol (β-ME), sa DTT považuje za bezpečnejšie a stabilnejšie redukčné činidlo. Je nielen stabilný vo vodnom roztoku, ale zachováva si svoje redukčné vlastnosti aj pri vysokej teplote a v acidobázických podmienkach.
Použitie DTT je relatívne jednoduché. Vo všeobecnosti sa DTT rozpustí vo vhodnom pufri a potom sa pridá do experimentálneho systému. Optimálna koncentrácia DTT sa musí určiť podľa konkrétneho experimentu a vo všeobecnosti sa používa v rozmedzí 0,1 – 1 mM. Nižšie koncentrácie môžu znížiť nepriaznivé účinky na rast buniek a znížiť cytotoxicitu spôsobenú nadmernou expresiou cieľových proteínov. Vyššie koncentrácie môžu spôsobiť nadmernú metabolickú záťaž buniek, čo ovplyvní rast buniek a účinnosť expresie.
Optimálnu koncentráciu možno určiť vyhodnotením úrovne expresie cieľového proteínu vykonaním indukčných testov IPTG pri rôznych koncentráciách. Testy v malom meradle sa môžu vykonávať s použitím rôznych koncentrácií IPTG (napr. 0,1 mM, 0,5 mM, 1 mM atď.) a účinok expresie pri rôznych koncentráciách sa môže vyhodnotiť detekciou úrovne expresie cieľového proteínu (napr. Western blot alebo fluorescenčná detekcia). Podľa experimentálnych výsledkov bola ako optimálna koncentrácia vybraná koncentrácia s najlepším účinkom expresie.
Okrem toho sa môžete odvolať aj na relevantnú literatúru alebo skúsenosti iných laboratórií, aby ste pochopili bežne používaný rozsah koncentrácií IPTG za podobných experimentálnych podmienok a potom ho optimalizovať a upraviť podľa experimentálnych potrieb.
Je dôležité poznamenať, že optimálna koncentrácia sa môže líšiť v závislosti od rôznych expresných systémov, cieľových proteínov a experimentálnych podmienok, preto je najlepšie optimalizovať ju individuálne.
Stručne povedané, DTT je bežne používané redukčné činidlo, ktoré sa môže použiť na redukciu disulfidových väzieb v proteínoch a iných biomolekulách a na ochranu aktivity a stability enzýmov. Široko sa používa v biochemických a molekulárno-biologických experimentoch.
Čas uverejnenia: 28. septembra 2023