Okolo nás je veľa neospevovaných hrdinov, ktorí sa zdajú byť obyčajní, no v skutočnosti nám potichu veľa prinášajú. Proteináza K je „neospevovaným hrdinom“ v odvetví molekulárnej diagnostiky, hoci v porovnaní s „veľkými a mocnými“ v tomto odvetví je proteináza K taká nenápadná, že sme dlho prehliadali jej dôležitosť. S vypuknutím novej koronavírusovej epidémie dopyt po proteináze K prudko vzrástol a ponuka doma aj v zahraničí výrazne zaostáva za spotrebou a všetci si zrazu uvedomili, aká dôležitá je proteináza K.
Aké je použitie proteinázy K?
Proteináza K je serínová proteáza s proteolytickou enzýmovou aktivitou a dokáže si udržať aktivitu v širokom rozsahu prostredí (pH (4-12,5), tlmivý roztok s vysokým obsahom soli, vysoká teplota 70 °C atď.). Okrem toho aktivitu proteinázy K neinhibuje SDS, močovina, EDTA, guanidín hydrochlorid, guanidín izotiokyanát atď. a určité množstvo detergentu môže tiež zvýšiť aktivitu proteinázy K. Proteináza K sa používa v medicíne (dezinfekcia vírusov a mikróbov), potravinách (zmäkčenie mäsa), koži (zmäkčenie vlasov), výrobe vína (čírenie alkoholu), príprave aminokyselín (degradované perie), extrakcii nukleových kyselín, hybridizácii in situ atď. Najčastejšie používanou aplikáciou je extrakcia nukleových kyselín.
Proteináza K dokáže enzymolyzovať všetky druhy proteínov vo vzorke vrátane histónov, ktoré sú pevne viazané na nukleové kyseliny, takže nukleové kyseliny sa môžu uvoľniť zo vzorky a uvoľniť do extraktu, čo uľahčuje ďalší krok extrakcie a purifikácie. Pri detekcii vírusovej nukleovej kyseliny je proteináza K jednou z dôležitých zložiek v roztoku na odber vzoriek vírusu. Proteináza K dokáže rozštiepiť a inaktivovať plášťový proteín vírusu, čo je bezpečnejšie počas fázy transportu a detekcie; okrem toho proteináza K dokáže tiež degradovať RNázu, ktorá zabraňuje degradácii vírusovej RNA a uľahčuje detekciu nukleovej kyseliny.
Proteinázu K si vyslúžila sláva cez noc
Či už v oblasti vedeckého výskumu alebo v oblasti diagnostiky in vitro, extrakcia nukleových kyselín je najzákladnejším experimentom, takže proteináza K vždy zohrávala veľmi dôležitú úlohu. V minulosti však bola proteináza K oveľa menej známa ako jej úloha. Z veľkej časti to bolo spôsobené tým, že vzťah ponuky a dopytu po proteináze K bol veľmi stabilný. Len málo ľudí by si myslelo, že ponuka proteinázy K bude problémom.
S vypuknutím novej koronavírusovej epidémie prudko vzrástol dopyt po testovaní nukleových kyselín. Koncom júna 2020 Čína dokončila takmer 90 miliónov nových testov na koronavírus a toto číslo je v celosvetovom meradle ešte alarmujúcejšie. V experimentoch s extrakciou nukleových kyselín je pracovná koncentrácia proteinázy K približne 50 – 200 μg/ml. Vo všeobecnosti je na extrakciu vzorky nukleovej kyseliny potrebných približne 100 μg proteinázy K. V praxi sa proteináza K často používa vo zvýšenom množstve, aby sa zvýšila účinnosť extrakcie nukleových kyselín. Detekcia nukleových kyselín nového koronavírusu priniesla veľký dopyt po proteináze K. Pôvodná rovnováha medzi ponukou a dopytom po proteináze K sa rýchlo narušila a proteináza K sa cez noc stala dôležitým materiálom na prevenciu epidémií.
Ťažkosti s produkciou proteinázy K
Hoci s rozvojom epidémie si ľudia cenia dôležitú hodnotu proteinázy K, je trápne, že kvôli jej príliš nízkej popularite sa do jej výroby zapojilo len málo domácich spoločností. Keď ľudia chcú zaviesť produkciu proteinázy K, počas výrobného procesu sa zistilo, že proteináza K je mimoriadne špeciálny proteín. Je mimoriadne náročné rozšíriť výrobnú kapacitu proteinázy K v krátkom čase.
Produkcia proteinázy K vo veľkom meradle čelí nasledujúcim ťažkostiam
1. Nízka expresia
Proteináza K môže nešpecificky degradovať väčšinu proteínov a spôsobiť vážnu toxicitu pre hostiteľskú bunku, v ktorej dochádza k expresii. Preto je hladina expresie proteinázy K vo všeobecnosti veľmi nízka. Skríning expresných systémov a kmeňov, ktoré vysoko exprimujú proteinázu K, si vo všeobecnosti vyžaduje dlhší cyklus.
2. Zvyšky pigmentov a nukleových kyselín
Fermentácia vo veľkom meradle zavádza veľké množstvo pigmentu a zvyškov nukleových kyselín hostiteľa. Je ťažké odstrániť tieto nečistoty jednoduchým procesom čistenia a zložité čistenie zvyšuje náklady a znižuje mieru výťažnosti.
3. Nestabilita
Proteináza K nie je dostatočne stabilná, môže sa sama enzymolyzovať a je ťažké ju dlhodobo stabilne skladovať pri teplote 37 °C bez ochranného činidla.
4. Ľahko sa vyzráža
Pri príprave lyofilizovaného prášku proteinázy K je potrebné pridať lyofilizované ochranné činidlo vo vysokej koncentrácii, aby sa zabezpečil vysoký obsah pevných látok v proteináze K. Keď však koncentrácia proteinázy K dosiahne 20 mg/ml a viac, ľahko sa vytvorí zrazenina, čo spôsobuje veľké ťažkosti pri lyofilizácii proteinázy K s vysokým obsahom pevných látok.
5. Veľká investícia
Proteináza K má silnú proteázovú aktivitu a dokáže v laboratóriu hydrolyzovať iné proteázy. Preto si proteináza K vyžaduje špecializované výrobné priestory, vybavenie a personál na výskum, vývoj a výrobu.
Roztok proteinázy K od XD BIOCHEM
Spoločnosť XD BIOCHEM má vyspelý systém expresie a purifikácie proteínov a bohaté skúsenosti s expresiou a purifikáciou rekombinantných proteínov a optimalizáciou výrobných procesov. Vďaka rýchlemu vytvoreniu výskumného a vývojového tímu sa podarilo prekonať rozsiahly výrobný proces proteinázy K. Mesačná produkcia lyofilizovaného prášku je viac ako 30 kg. Produkt má stabilný výkon, vysokú špecifickú aktivitu enzýmov a neobsahuje žiadne zvyšky hostiteľského cytochrómu a nukleových kyselín. Neváhajte kontaktovať spoločnosť XD BIOCHEM. Získajte skúšobný balíček (e-mail:sales@xdbiochem.comTel.: +86 513 81163739).
Technické riešenia spoločnosti XD BIOCHEM zahŕňajú
Pomocou integrácie viacnásobných plazmidov sa selektujú kmene s vysokou expresiou a úrovňou expresie 8 g/l, čo prekonáva problém nízkej úrovne expresie proteinázy K.
Zavedením viacstupňového purifikačného procesu boli hostiteľské cytochrómy a zvyšky nukleových kyselín proteinázy K úspešne odstránené pod štandardnú hodnotu.
Prostredníctvom vysokovýkonného skríningu formulácií ochranných pufrov bol vybraný pufor, ktorý dokáže stabilne skladovať proteinázu K pri teplote 37 °C.
Skríningové pufre prekonávajú problém, že proteináza K sa ľahko agreguje a precipituje pri vysokých koncentráciách, a kladú základy pre lyofilizáciu proteinázy K s vysokým obsahom pevných látok.
Vzorka proteinázy K XD BIOCHEM
Test stability proteinázy K XD BIOCHEM: po 80 dňoch pri izbovej teplote nedôjde k žiadnej významnej zmene aktivity
Test stability proteinázy K XD BIOCHEM: po 80 dňoch pri izbovej teplote nedôjde k žiadnej významnej zmene aktivity.
Porovnanie účinku extrakcie nukleových kyselín s proteinázou K XD BIOCHEM a konkurenčnými produktmi. V procese extrakcie nukleových kyselín sa používa proteináza K XD BIOCHEM a konkurenčná proteináza K. Účinnosť extrakcie proteinázy K XD BIOCHEM je vyššia a hodnota Ct cieľového génu je nižšia.
Čas uverejnenia: 31. decembra 2021